高效液相层析
《分析实验》(武汉大学)上有详细的介绍……
k2CrO42-的如果过多,终点提前;k2CrO42-的如果过少,终点滞后.当终点体积为:100mL溶液中加入5%溶液k2CrO42-2mL.
检测目的基因是否表达
首先要确认目的基因已经传入受体细胞.然后再检测其表达情况,一般有两种方法:一个是通过特定性状来判断目的基因是否表达,比如导入的目的基因是编码某种酶的,那么最简便有效的方法就是经过表达后检测有没有相应酶的活力,同时跑蛋白胶,看有没有预期的目的条带,因为对于酶来说,有时候目的基因虽然表达了,但是酶没有活力,这时就不是表达甫紶颠咳郯纠奠穴订膜的问题了.另外一个就是利用抗原-抗体特异性结合原理,检测目的基因是否翻译成蛋白
最直接的就是检测目的蛋白,一般都是用western blot;如果是分泌蛋白,可以做elisa;如果蛋白有特殊的功能(比如gfp,绿色荧光蛋白),也可以直接检测其功能(比如看有无绿色荧光). 间接的话,可以检测目的mrna是否存在,用的是northern blot或者rt-pcr.要注意的是,因为翻译阶段有可能存在调控,所以有些情况下mrna存在不代表蛋白存在,即基因转录了未必翻译.所以间接的手段一般作为旁证.
反转录法:1、培养目的基因所在生物细胞一定的时间.2、用试剂盒或者传统的Trizol法获取mRNA.3、配置RT-PCR反应体系,反转录生成cDNA.4、使用目的基因涉及的引物对cDNA进行PCR反应.同时设置对照组使用持家基因的引物PCR.(验证mRNA的成功提取和cDNA的成功得到)5、琼脂糖凝胶电泳,若有目的条带,则说明表达了.
检测目的基因的方法
首先要确认目的基因已经传入受体细胞.然后再检测其表达情况,一般有两种方法:一个是通过特定性状来判断目的基因是否表达,比如导入的目的基因是编码某种酶的,那么最简便有效的方法就是经过表达后检测有没有相应酶的活力,同时跑蛋白胶,看有没有预期的目的条带,因为对于酶来说,有时候目的基因虽然表达了,但是酶没有活力,这时就不是表达甫紶颠咳郯纠奠穴订膜的问题了.另外一个就是利用抗原-抗体特异性结合原理,检测目的基因是否翻译成蛋白
细胞水平:如果转进去的目的基因带有标记,例如荧光,那么用倒置荧光显微镜就可以看到,有荧光,则基因表达,当然这必须细胞本身没有荧光才行.蛋白水平:将样品收集,裂解,用蛋白免疫印记法(western blot)来检测,根据曝光条带判断有无目的蛋白的表达,从而证实基因的表达.分子水平:样品提rna,做逆转录pcr(rt-pcr),之后以逆转录完成的cdna为模板,用设计好的引物对此模板进行pcr扩增,之后电泳检测,看是否有目的基因dna;或者直接用实时定量荧光pcr(qpcr)来检测目的基因的表达(根据图谱来看).
获取目的基因的方法主要有两种:一是从供体细胞的DNA中直接分离基因,最常用的方法是“鸟枪法”又叫“散弹射击法＂,另一种是人工合成基因,这种方法有两条途径,二是以目的基因转录的信使RNA为模板,反转录成互补的单链DNA,再在酶的作用下合成双链DNA,即目的基因,另一条途径是蛋白质的氨基酸序列,推测出信使RNA序列,再推测出结构基因的核苷酸序列,然后用化学的方法以单核苷酸为原料合成.
检测目的基因mrna表达
蛋白质
ct值是通过pcr仪的分析软件直接得出 的,一般要做一个看家基因座内参
先提取RNA,反转录成cDNA,然后根据目的基因设计PCR引物,通过半定量RT-PCR确定目的基因表达. 正因为检测的是mRNA,所以要先反转录成cDNA才能PCR.
检测基因是否成功表达
应用分子杂交进行检测.分子杂交技术:不同的dna 片段之间,dna 片段与rna 片段之间,如果彼此间的核苷酸排列顺序互补也可以复性,形成新的双螺旋结构.这种按照互补碱基配对而使不完全互补的两条多核苷酸相互结合的过程称为分子杂交.检测目的基因是否进行转录,即有无互补rna产生,可以使用分子杂交技术.
目的基因片段后偶联一个抗生素的抗性基因片段,将他们作为一个整体的目的基因片段导入受体.用该抗生素在受体上做一个杀伤曲线,根据这个曲线选择合适的抗生素浓度,在培养受体时加压筛选,能够留下来的受体都是已经成功导入了目的基因的.
首先得看是真核表达还是原核表达.不过都可以提取mRNA做个Real-Time PCR,检测外源基因有没有转录成mRNA,并且转录效率高不高.再做个Western blot,直接检测蛋白表达与否和相对表达量.一个是转录的核酸水平,一个是翻译的蛋白水平,都是分子水平.不过不知道高中生物学到这了么
检测目的基因表达4层次
首先要确认目的基因已经传入受体细胞.然后再检测其表达情况,一般有两种方法:一个是通过特定性状来判断目的基因是否表达,比如导入的目的基因是编码某种酶的,那么最简便有效的方法就是经过表达后检测有没有相应酶的活力,同时跑蛋白胶,看有没有预期的目的条带,因为对于酶来说,有时候目的基因虽然表达了,但是酶没有活力,这时就不是表达甫紶颠咳郯纠奠穴订膜的问题了.另外一个就是利用抗原-抗体特异性结合原理,检测目的基因是否翻译成蛋白
就是检测目的基因是否复制,转录与翻译,例如你导入了胰岛素基因,就要检测那个细胞里是否存在胰岛素基因和对应rna和蛋白质
最直接的就是检测目的蛋白,一般都是用western blot;如果是分泌蛋白,可以做elisa;如果蛋白有特殊的功能(比如gfp,绿色荧光蛋白),也可以直接检测其功能(比如看有无绿色荧光). 间接的话,可以检测目的mrna是否存在,用的是northern blot或者rt-pcr.要注意的是,因为翻译阶段有可能存在调控,所以有些情况下mrna存在不代表蛋白存在,即基因转录了未必翻译.所以间接的手段一般作为旁证.